Los Lactobacilos, reconocidos por ser bacterias lácticas grampositivas con un rol fundamental en la salud humana y en la industria alimentaria, han constituido durante décadas un pilar en la producción de alimentos fermentados y suplementos probióticos. Sin embargo, a pesar de su amplio uso y los numerosos beneficios atribuidos, como la modulación del microbioma intestinal, la mejora de la función inmune y el alivio de trastornos psicológicos relacionados con el estrés, los mecanismos genéticos y moleculares que sustentan estas propiedades no se encuentran aún completamente comprendidos. En este contexto, la aplicación de tecnologías de ingeniería genética específicas para Lactobacilos se constituye en una herramienta esencial para avanzar tanto en el estudio funcional como en la mejora precisa de estas bacterias con fines terapéuticos y alimentarios. La edición genética en bacterias ha avanzado notablemente con la irrupción del sistema CRISPR-Cas9, que se ha consolidado como un recurso potente, eficiente y versátil para modificar secuencias genéticas específicas. Sin embargo, el uso tradicional de CRISPR-Cas9 en Lactobacilos presenta desafíos importantes.
La generación de rupturas de doble cadena en el ADN, mecanismo fundamental para la edición con Cas9 nativo, causa citotoxicidad considerable en muchas especies bacterianas debido a su limitada capacidad para reparar estas rupturas. Esto restringe la eficiencia de la edición y limita las posibilidades para intervenir múltiples sitios genómicos simultáneamente. A su vez, la necesidad de proveer fragmentos de ADN donante para reparar dichas rupturas añade complejidad al proceso y dificulta la obtención de resultados estables y rápidos. Ante esta situación, la base de edición emerge como una innovadora alternativa para la ingeniería genética de bacterias. Esta técnica, que se basa en la fusión de enzimas desaminasas con variantes inactivas o parcialmente activas de Cas9, permite realizar conversiones específicas de bases nitrogenadas sin generar rupturas en el ADN.
En particular, la eficiencia y menor toxicidad inherente a los sistemas de edición por base permiten superar las limitaciones del sistema CRISPR-Cas9 clásico, posibilitando ediciones precisas y la multiplexación —la edición simultánea de varios loci— con una menor inversión de recursos. En el ámbito de los Lactobacilos, sin embargo, la aplicación práctica de base editores era hasta hace poco limitado. Específicamente, los avances previos se centraban principalmente en Lactobacillus lactis, quedando ausente un sistema versátil para especies con aplicación probiótica e industrial de mayor impacto, como Lactiplantibacillus plantarum o Lactobacillus gasseri. Por lo tanto, la reciente implementación y optimización de un sistema de edición por base denominado Target-AID específicamente adaptado para Lactobacilos representa un salto cualitativo substancial para la microbiología aplicada y la biotecnología alimentaria. Target-AID incorpora una citosina desaminasa derivada del pez lamprea y un inhibidor de la glicosilasa de uracilo, integrados en un plasmido con un origen de replicación compatible con una variedad de bacterias lácticas.
Su diseño permite la conversión dirigida de citosinas a timinas (C a T) con una precisión elevada sobre una ventana de edición caracterizada dentro de la secuencia objetivo del genoma. Gracias a la capacidad de evitar rupturas en el ADN y dispensar el uso de ADN donante, Target-AID reduce la citotoxicidad inducida, incrementando la viabilidad celular post-edición y facilitando ediciones múltiples simultáneas en loci diferentes. La aplicación de Target-AID en Lactiplantibacillus plantarum ha demostrado ser altamente eficiente, alcanzando tasas de edición cercanas al 100% en algunos casos. Este logro fue posible mediante la adaptacion de elementos promotores y terminadores adecuados para maximizar la expresión de los componentes del sistema en las bacterias diana. Adicionalmente, la implementación de versiones que emplean Cas9 nickasa o Cas9 desactivado evidenció que la inclusión del inhibidor de glicosilasa fue vital para evitar reparaciones no deseadas y potenciar las conversiones base a base.
Un avance de peso en la funcionalidad del sistema es la facilidad para realizar ediciones multiplexadas, lo que reduce significativamente el tiempo y los recursos necesarios para modificar simultáneamente múltiples genes, una tarea compleja con las técnicas de recombinación basadas en DNA donante. De esta manera, es posible diseñar cepas con múltiples características mejoradas de forma combinada, ampliando su potencial industrial y probiótico. Una aplicación práctica destacada fue la ingeniería genética dirigida a Lactiplantibacillus plantarum para reducir la producción de imidazol propionato (ImP), un metabolito microbiano que se ha vinculado con la diabetes tipo 2 debido a su impacto negativo sobre la tolerancia a la glucosa y la señalización de la insulina. La edición dirigida mediante Target-AID del gen urdA, que codifica la enzima urocanato reductasa responsable en la ruta de producción de ImP, permitió generar una versión de L. plantarum con disminución significativa de ImP.
Este resultado no afectó el crecimiento ni la capacidad de fermentación de la cepa, abriendo posibilidades para desarrollar probióticos más seguros y con beneficios metabólicos específicos para la población potencialmente afectada por enfermedades metabólicas. Además de aplicaciones prácticas, el sistema permitió la experimentación sobre genes esenciales. Por ejemplo, la edición puntual del gen ftsZ, conductor indispensable para la división celular bacteriana, se logró mediante mutaciones específicas introducidas con Target-AID que provocaron fenotipos celulares filamentosos. La observación de estos fenotipos en poblaciones mixtas permitió analizar funciones esenciales sin necesidad de generar mutaciones letales completas ni insertar ADN extraño. Este enfoque novedoso ofrece un método para investigar funciones genéticas vitales y su impacto en los microorganismos, crucial para avanzar en la biología fundamental y para la optimización de cepas probióticas.
La adaptabilidad del sistema a otras especies de Lactobacillus, como L. gasseri, también fue confirmada, reafirmando su potencial de uso en distintas aplicaciones industriales y médicas. No obstante, la elección adecuada de promotores y otros elementos regulatorios resultó clave para el éxito en diferentes especies, destacando la importancia de la personalización molecular al diseñar herramientas de edición genética para distintos microorganismos. En términos regulatorios y de aceptación social, el uso de edición por base ofrece ventajas significativas al evitar la incorporación de segmentos de ADN extraño que caracterizan a los organismos transgénicos convencionales. La modificación puntual y precisa sin inserción de genes puede resultar indistinguible de mutaciones naturales, lo que en algunas jurisdicciones exime a estos organismos de la regulación estricta aplicada a los organismos genéticamente modificados (OGM).
Esto representa una oportunidad para acelerar el desarrollo y la comercialización de probióticos mejorados basados en Lactobacilos, sin enfrentar barreras legales o sociales inadvertidas. Mientras la edición genética avanza en el campo de los microorganismos probióticos, es esencial mantener un equilibrio ético y de transparencia que involucre a consumidores, reguladores y científicos. La información clara sobre las modificaciones, sus impactos positivos en la salud y la seguridad probada jugarán un papel fundamental para fomentar la confianza pública en estos innovadores productos. En resumen, el desarrollo del sistema Target-AID para la edición por base en Lactobacilos abre nuevas fronteras en la ciencia y tecnología de probióticos. Facilita la producción de cepas con características personalizadas, capaces de mejorar la salud humana y adaptarse a aplicaciones industriales específicas.
Simultáneamente, es una herramienta poderosa para la investigación básica enfocada en la genética y funciones celulares esenciales, elevando el potencial para el avance de la microbiología aplicada a la salud y la alimentación. Esta innovación representa un paso decisivo hacia una nueva generación de probióticos con beneficios optimizados y un modelo para la aplicación segura y responsable de tecnologías genéticas en microorganismos beneficiosos.
