Los Lactobacilos, un género crucial de bacterias grampositivas conocidas por su papel vital en la fermentación de alimentos y los beneficios probióticos, han sido durante décadas objeto de investigación por su influencia positiva en la salud humana y animal. Estos microorganismos, presentes en distintas partes del cuerpo humano como el tracto gastrointestinal, la boca y el aparato genitourinario, son comúnmente utilizados en productos fermentados como yogur y queso, aportando tanto mejoras nutricionales como efectos terapéuticos. Sin embargo, a pesar de su uso prolongado y reconocimiento como microorganismos generalmente seguros, aún persisten muchas incógnitas en torno a sus mecanismos genéticos y moleculares para impartir tales beneficios. La necesidad imperiosa de herramientas genéticas precisas y eficientes orientadas a Lactobacilos es entonces evidente, para optimizar su aplicación como probióticos y terapéuticos. En la última década, la tecnología CRISPR-Cas9 ha transformado el panorama de la ingeniería genética, posicionándose como una herramienta poderosa gracias a su precisión y facilidad para introducir modificaciones en el genoma.
Particularmente, el uso de Cas9 con ARN guía facilita el corte específico del ADN en secuencias determinadas, que tras la reparación celular puede resultar en mutaciones. Sin embargo, las aplicaciones directas de CRISPR-Cas9 en bacterias Lactobacillus enfrentan limitaciones debido a la toxicidad que genera en estas células la ruptura doble cadena del ADN y a procesos de reparación poco eficientes en estos microorganismos. Estos inconvenientes dificultan además la edición simultánea de múltiples loci, lo cual es deseable para el desarrollo de cepas con características complejas mejoradas. Una solución innovadora que ha emergido es la edición de bases, una técnica que permite la conversión precisa de una base nitrogenada por otra sin necesidad de introducir rupturas en el ADN ni utilizar plantillas de donantes para la recombinación. Entre las herramientas de edición de bases, resalta el sistema Target-AID que combina un Cas9 modificado incapaz de cortar el ADN con una enzima desaminasa, permitiendo convertir citosinas en timinas en lugares específicos del genoma.
Esta tecnología no solo reduce la citotoxicidad sino que además facilita la edición múltiple sin requerir una compleja inserción de ADN exógeno. Recientemente, un grupo de investigadores desarrolló y optimizó un sistema de edición de bases basado en Target-AID dirigido específicamente a Lactobacilos, incluyendo especies relevantes como Lactiplantibacillus plantarum y Lactobacillus gasseri. El sistema fue diseñado para expresar separadamente las proteínas claves, incluyendo una variante de Cas9 con actividad de nickasa o inactiva, la desaminasa de citosina PmCDA1 y un inhibidor de la glicosilasa de uracilo para impedir la reparación del cambio deseado. La expresión coordinada de los componentes fue gestionada mediante la elección y ajuste de promotores y terminadores específicos para asegurar alta eficiencia y estabilidad de las moléculas de ARN necesarias para guiar la edición genética. Uno de los avances más destacados fue lograr una eficiencia de edición próxima al 100% en la modificación de genes objetivo en L.
plantarum, con la posibilidad de editar múltiples loci simultáneamente a través de la expresión de crRNAs múltiples. La multiplexación en estas bacterias es especialmente valiosa para acelerar la obtención de cepas con rasgos combinados, por ejemplo, la mejora de actividad probiótica junto con la reducción de moléculas potencialmente dañinas producidas de forma natural. Un caso práctico de aplicación fue la modificación de la ruta metabólica involucrada en la producción del metabolito imidazol propionato (ImP). Este compuesto, generado a través de la degradación del aminoácido histidina por la acción de la enzima urocanato reductasa (urdA), ha sido correlacionado con el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2. Varias cepas de Lactobacillus portadoras del gen urdA son más abundantes en pacientes diabéticos, lo que sugiere que la modificación de dicho gen podría disminuir la producción de ImP y, por ende, mitigar este riesgo metabólico.
Mediante la edición exacta del gen urdA en L. plantarum, los investigadores lograron generar cepas que mantienen un crecimiento y fermentación normales pero con una reducción de más de diez veces en la producción de ImP. Dichas cepas representan un gran avance para la industria alimentaria y probiótica, permitiendo el desarrollo de productos con menor impacto adverso en la salud metabólica sin la incorporación de material genético exógeno, lo cual ayuda a superar barreras regulatorias y de aceptación social asociadas a organismos modificados genéticamente convencionales. Además del desarrollo de cepas mejoradas para aplicaciones prácticas, el sistema Target-AID base editing ha facilitado el estudio funcional de genes esenciales. La investigación sobre la proteína FtsZ —un regulador clave de la división celular bacteriana cuya inactivación resulta en filamentos celulares anormales y muerte celular— mostró que el sistema permitió la edición transitoria de este gen, posibilitando observar fenotipos intermedios y entender la importancia funcional de diferentes regiones proteicas.
La capacidad de generar mutantes transitorios evita el problema de la inviabilidad de mutaciones letales, ofreciendo una herramienta potente para la investigación básica en bacterias probióticas y otros microorganismos no modelo. Importante es destacar que el sistema desarrollado ha sido adaptado para funcionar en distintas especies de Lactobacillus, gracias a la selección cuidadosa de promotores y elementos genéticos compatibles con sus contextos fisiológicos. Esto amplía el espectro de aplicación de la herramienta en la biotecnología microbiana y la medicina, permitiendo la edición precisa, eficiente y multiplexada sin generar daños colaterales graves en las células objetivo. La introducción de esta tecnología de edición de bases en bacterias probióticas abre un camino prometedor para la ingeniería racional de cepas con mejoras específicas y seguras, potenciando sus beneficios para la salud humana. La ausencia de inserciones de ADN externo y la similitud de las mutaciones con cambios naturales favorecen que los productos desarrollados sean considerados libres de organismos genéticamente modificados bajo ciertas normativas, facilitando su comercialización y uso.
En un futuro cercano, es probable que la combinación de esta técnica con análisis genómicos, transcriptómicos y metabolómicos permita descubrir, diseñar y optimizar con rapidez probióticos personalizados, tanto para tratar enfermedades metabólicas y autoinmunes como para mejorar la salud gastrointestinal y neurológica. Además, la capacidad para alterar múltiples genes simultáneamente facilitará la generación de cepas con múltiples ventajas, tales como resistencia a factores adversos, mejor colonización intestinal y producción aumentada de compuestos benéficos. En definitiva, la implementación del sistema de edición de bases Target-AID en Lactobacilos representa un salto significativo en la ingeniería genética microbiana, alineado con las demandas actuales de la biotecnología responsable y la medicina de precisión. Proporciona una plataforma versátil para la mejora genética profunda de probióticos, un área con gran potencial para impactar positivamente la salud global y la industria alimentaria, mientras se minimizan riesgos y preocupaciones éticas y regulatorias.
